实验二 糖的薄层层析

【原理】

层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别（如吸附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以不同的程度分布在两个相中。其中固定不动的称固定相，流过此固定相的液体或气体称流动相。从而使各组分以不同的速度随流动相向前移动而达到分离的目的。

20世纪初发现植物中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，从而可以分离提取植物色素，故称为色层分离法。后来无色物质也可利用吸附柱分离。1944年开始用滤纸做为固定相而出现了纸层析后，层析法不断发展，成为生物化学中最常用的方法之一。根据其层析过程的机理不同，层析法不断发展，成为生物化学中最常用的方法之一。根据其层析过程的机理不同，层析可分为以下几种：

（1）吸附层析：利用吸附剂对各种物质吸附能力的不同，来达到分离的目的。

（2）分配层析：利用各种不同的物质在两种不同溶剂中的分配系数的不同而达到分离的目的。

（3）离子交换层析：是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力，而使其达到分离的目的。

（4）凝胶层析（分子筛层析）：是根据混合物中各种分子的大小及形状不同，通过凝胶时，分子的扩散移动速率各异，而使大小不同的分子得到分离。

（5）亲和层析：是利用高分子物质能与相应的配基特异性的可逆结合的原理而进行分离。

层析法按操作的方式不同，又可分为柱层析、纸层析和薄层层析等。

硅胶具有吸附其他物质的性能，而且它对各种糖的吸附能力是各不相同的。本实验就利用这种吸附能力的差异，将硅胶在玻璃板上均匀地铺成薄层，而后将糖的混合液点在薄层上，再用乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸和水按一定比例构成的混合液为展开剂进行层析，能使混合的糖分离。再用Molish氏反应使糖显色，其反应式如下：

层析的结果，可测得被测物质的Rf值。Rf值是用来表示物质被分离后的位置的数值，即物质的迁移率。它是被测物质的移动距离与溶剂移动距离之比。一般应用同一吸附剂和同一溶剂系统展开时，其Rf应相对恒定。因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。但是被测物质Rf值尚与所用的操作方法、吸附剂的品质、薄层的厚度、溶剂的质量、滴加样品的数量以及层析缸中蒸气的饱和度等条件有关。为了避免上述因素的影响，一般都使用已知样品与被测样品在同一薄层上，在相同条件下层析，对照所得的Rf值而进行定性鉴定。

【操作】

（1）薄板制备：称取硅胶G 2.5g于研钵中，加0.02mol/L硼酸溶液10mL，研调成均匀糊状，铺于5cm×15cm的玻璃板上。晃动玻璃板，使之均匀分布。置室温20分钟凝固后，置110℃烘箱中烘干半小时备用。

（2）点样：用毛细管分别吸取乳糖、葡萄糖、甘油醛以及三者的混合液各少许，在距薄板一端1.5cm的起点线处，间距1cm分别点样。点样的直径应小于3mm，待样品干燥后展开。

（3）展开：以薄板30°倾斜放置于层析缸中，后慢慢沿缸壁注入展开剂约0.5cm厚度（注意展开剂的高度必须在薄板的起点线以下），展开剂其体积比为乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水=12∶3∶3∶2。密闭层析缸，让其展开。当溶剂的前沿升高到距薄层顶端1cm处，取出薄板于室温干燥10分钟后置80℃烘箱中烘10分钟。

（4）显色：向薄板均匀喷洒α-萘酚-硫酸试剂，置110℃烘箱中烘3～5分钟到斑点显出为止。

（5）求出各点的Rf值。

【附注】

（1）。

（2）薄层层析法的优点是：①设备简单，操作容易。②层析展开时间短，只需数分钟到几小时，即可获得结果。③分离时几乎不受温度的影响。④可采用腐蚀性的显色剂而且可以在高温下显色。⑤分离效率高。

（3）本实验用0.02mol/L硼酸或用0.02mol/L醋酸钠代替水来调制硅胶板，可使Rf值比较接近的糖得到更好的分离。

【试剂】

（1）硅胶G。

（2）0.02mol/L硼酸溶液。

（3）2%乳糖溶液。

（4）2%葡萄糖溶液。

（5）2%甘油醛溶液。

（6）2%乳糖溶液、2%葡萄糖、2%甘油醛等体积的混合液。

（7）展开剂：乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（12∶3∶3∶2）。

（8）α-萘酚-硫酸试剂（Molish试剂）:15%α-萘酚乙醇溶液21mL，加浓硫酸13mL，再加乙醇81mL及水8mL混匀置棕色瓶中。要新鲜配制。