上QQ阅读APP看书，第一时间看更新
第三节 丹参配方颗粒标准汤剂研究
一、丹参标准汤剂的制备
丹参标准汤剂的制备工艺研究，均按照国家药典委员会起草的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》中“标准汤剂的制备”有关要求进行，根据研究结果，确定丹参标准汤剂的制备方法如下：
取丹参饮片100g，称定重量，加水煎煮两次，第一次煎煮加9倍量水，浸泡30 分钟，武火煮沸后再文火煎煮20分钟，用350目标准筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；第二次煎煮加7倍量水，武火煮沸后改文火煎煮20分钟，用350目标准筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；滤液减压浓缩至适量，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥（真空冷冻干燥工艺参数见表7-3-1，冻干曲线见图7-3-1），取出，轧铝盖即得。丹参标准汤剂样品制备测定数据见表7-3-2。
表7-3-1 丹参标准汤剂冷冻干燥参数设置
图7-3-1 丹参标准汤剂冻干曲线图
表7-3-2 丹参标准汤剂样品制备测定数据
二、含量测定
（一）色谱条件
色谱柱：CORTECS UPLC T3（100mm×2.1mm，粒径为 1.6μm）；流动相：乙腈：0.1% 磷酸溶液（20：80）；流速：每分钟0.4ml；检测波长：286nm，柱温：25℃。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于10 000。
（二）对照品溶液的制备
取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇-水（8：2）混合溶液制成每1ml含0.1mg溶液，即得。
（三）供试品溶液的制备
取丹参标准汤剂，研细，约40mg，精密称定，置20ml量瓶，加水12ml，摇匀，超声处理（功率500W，频率40kHz）10分钟，放冷，定容，滤过，弃去初滤液，取续滤液即得。
（四）方法学验证
方法学考察合格（具体内容略）。
（五）测定结果
取所制备的23批丹参标准汤剂，每批平行2份。按“含量测定”项下方法测丹酚酸B含量，并计算转移率，结果见表7-3-3。
表7-3-3 丹参标准汤剂含量测定结果
续表
三、特征图谱
测定方法同“第二节”中“特征图谱”项。
（一）方法学考察
1.专属性考察
取丹参标准汤剂供试品溶液（DS-T-04）、空白溶剂、迷迭香酸参照物溶液、丹酚酸B参照物溶液，注入液相色谱仪，按已确定的色谱条件测定，记录色谱图（图7-3-2）。
图7-3-2 专属性对比图
结果：丹参标准汤剂5个色谱峰不受阴性空白溶剂的干扰，其中标准汤剂中特征图谱迷迭香酸峰、丹酚酸B峰与丹参标准汤剂溶液的保留时间一致，本方法具有良好的专属性。
2.精密度考察
取丹参标准汤剂供试品溶液（DS-T-04），按已确定的色谱条件连续进样6次进行测定，以迷迭香酸色谱峰（峰4）为参照峰S，计算峰1～6的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，结果见表7-3-4。
表7-3-4 丹参标准汤剂特征图谱精密度考察结果
结果：在连续进样6次的精密度考察中，丹参标准汤剂6个色谱峰相对保留时间的RSD小于2%，相对峰面积的RSD小于2%，表明该特征图谱方法精密度良好。
3.稳定性考察
取丹参标准汤剂（DS-T-04），按供试品溶液制备方法制备供试液，分别在 0、2.5、5、7、9.5、12、18、24 小时进样一次，共测定 24 小时，进样 1μl，考察各时间点各特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表7-3-5。
表7-3-5 丹参标准汤剂特征图谱稳定性考察结果
结果：供试品溶液在24小时内，6个色谱峰相对保留时间的RSD范围在1.5%以内，相对峰面积的RSD范围在2%以内，表明该方法下供试品溶液在12小时内稳定。
4.重复性考察
取丹参标准汤剂（DS-T-04），平行6份，按丹参标准汤剂特征图谱项下方法制备6份供试品溶液，进样测定，以迷迭香酸色谱峰为参照峰S，计算峰1～6的相对保留时间以及相对峰面积，并计算RSD值，实验结果见表7-3-6。
表7-3-6 丹参标准汤剂特征图谱重复性考察结果
结果：在平行6个供试品溶液中，丹参标准汤剂6个色谱峰相对保留时间的RSD范围在1%以内，相对峰面积的RSD范围在1%以内，表明该特征图谱方法重复性良好。
5.中间精密度考察
取丹参标准剂样品（DS-T-04），由2位分析人员，分别按丹参标准汤剂特征图谱项下供试品溶液制备方法制备供试液各6份，在不同时间，不同仪器上各进样1μl，考察各特征峰相对保留时间、相对峰面积的一致性，结果见表7-3-7。
表7-3-7 丹参标准汤剂特征图谱重复性考察结果
续表
结果：各特征峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，中间精密度良好。
（二）测定结果
按拟定的方法测定不同批次丹参标准汤剂样品的UPLC图谱，采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行结果分析，以多批样品生成对照特征图谱（图7-3-3、图7-3-4），选择迷迭香酸峰作为参照峰（即S峰），计算各特征峰与S峰的相对峰面积和相对保留时间（表7-3-8）。
图7-3-3 丹参标准汤剂特征图谱
图7-3-4 丹参标准汤剂对照特征图谱
峰1：丹参素；峰2：原儿茶醛；峰3：咖啡酸；峰4（S）：迷迭香酸；峰5：紫草酸；峰6：丹酚酸B
表7-3-8 丹参标准汤剂样品特征图谱测定结果
续表
根据多批丹参标准汤剂样品生成的对照特征图谱保留时间结果，确定供试品特征图谱中应呈现6个特征峰，其中2个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同；与迷迭香酸参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10%范围之内，相对保留时间规定值为：0.30（峰 1）；0.44（峰 2）；0.57（峰 3）；1.00（峰 4）；1.04（峰 5）。计算峰1、2、6与S峰的相对峰面积，峰1、峰2的相对峰面积之和与峰6的相对峰面积比值应不高于0.10。
（三）色谱峰的指认
采用液质联用技术，结合对照品对照，对丹参标准汤剂特征图谱中的主要特征峰进行了指认。
1.实验条件
（1）供试品制备：
取丹参标准汤剂（DS-T-04）适量，研细，精密称取50.66mg，置50ml容量瓶，加入50%甲醇适量，超声处理（功率500W，频率40kHz）10分钟，放冷，加50%甲醇定容至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。分别取丹参素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、异紫草酸、丹酚酸B对照品适量，加入超纯水溶解，作为混和对照品溶液。
（2）分析方法：
液相色谱条件：Waters I-Class UPLC液相色谱仪，CORTECS UPLC T3，（100mm×2.1mm，1.6μm）色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，按表7-3-9中的规定进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；检测波长为280nm；柱温为30℃；进样体积为 1μl。
表7-3-9 洗脱梯度
质谱条件：Waters Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱仪；ESI模式为：正、负离子扫描，质量数范围： m/z 500～1500 ；干燥气体流速（N 2）：800L/h；干燥气体温度：400℃；毛细管电压：2.5kV；锥孔电压：40V；应用MSE一级二级全扫描的采集模式。
2.数据分析
将供试品与混合对照品各进样1μl，数据采用MassLynx TM 4.1进行分析处理。主要色谱峰相关的色谱图（图7-3-5）及质谱信息（表7-3-10）如下：
图7-3-5 丹参标准汤剂特征峰指认——总离子流图与紫外色谱图
表7-3-10 丹参标准汤剂特征峰指认结果表
续表
*表示经对照品定位； #表示与文献信息匹配。
本研究对丹参标准汤剂的制备工艺进行了考察，制定了丹参标准汤剂的制备方法。根据丹参标准汤剂的出膏率及主要成分丹酚酸B的转移率，制定了丹参标准汤剂中丹酚酸B的含量及转移率范围，建立了丹参标准汤剂特征图谱，采用液质联用的方法指认了特征峰，并对丹参标准汤剂特征图谱的特征峰相对峰面积设定了限量标准，为丹参配方颗粒生产工艺的研究提供了较全面的参考。