1.2　荧光共振能量转移

荧光共振能量转移（FRET）是1948年由科学家Förster首先提出的［1］，故称之为Förster能量转移。Förster指出，能量转移效率与供体、受体之间距离的六次幂的倒数成正比。据此，Stryer及Haugland在1967年用具体的实验证实了Förster的预见［2］，并提出FRET可以作为光学分子尺，用来测定生物体系中1.0～6.0nm的距离。随后，在1978年，Stryer详细地综述了FRET在蛋白质结构分析中的广泛应用［3］。FRET是一种均相的分析检测技术，它可以作为生物体系中1.0～10.0nm范围内极为有效的光学分子尺，在不断的发展和完善的过程之中，逐渐出现了一些新的技术和新的方法，如荧光共振能量转移显微术［4］、时间分辨荧光共振能量转移（Time-Resolved FRET，TR-FRET）［5，6］、双光子激发荧光共振能量转移（Two-Photon Excited FRET，TPE-FRET）［7～9］等，并将不断地向前发展。

1.2.1　FRET的基本原理

荧光共振能量转移（FRET）是指两个不同的荧光基团，其中一个荧光基团作为能量供体（Donor，D），另外一个作为能量受体（Acceptor，A），能量供体的发射光谱与能量受体的激发光谱能够有效地重叠，并且二者之间的距离处于1.0～10.0nm之间，当用能量供体的激发光来激发时，就能够观察到供体的能量向受体转移这一现象的发生。具体发生过程如下：供体分子被激发光激发后，由基态跃迁至激发态，并在此过程中产生振荡偶极子，供体分子的振荡偶极子与附近的受体分子的偶极子能够发生共振。由于偶极-偶极之间的相互作用，处于激发态的供体分子能够将一部分或者全部的能量通过非辐射跃迁的方式转移给受体，从而使受体分子被激发。在此过程中，供体分子的荧光强度降低，而受体分子的荧光强度增强，若受体为淬灭剂则不发荧光，即为荧光淬灭现象，同时还会出现能量供体的荧光寿命降低或者能量受体受体荧光寿命的增大的现象，如图1-1所示。在整个的能量转移过程之中，无光子的发射现象，也没有光子的重新吸收的参与，因此，FRET是一种非辐射的能量转移。

图1-1　荧光共振能量转移示意图

FRET的发生需要满足四个条件：①能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱在一定程度上能够有效地重叠；②供体的荧光量子产率和受体的摩尔吸光吸收系数需要足够大；③供体与受体间的距离要在1±0.5R0之内（其中R0为Förster半径，详见下文）［10］；④能量供体和受体的跃迁偶极矩应具有一定的相对取向，或者两者中任意一个具有任意旋转的自由度。

1.2.2　FRET能量转移效率

FRET能量转移效率E的大小取决于能量供体和受体的光谱重叠程度、二者之间的距离以及二者偶极矩的相对取向等因素，可以用Förster方程表示，如下：

　　 （1-1）

　　 （1-2）

式中，r为能量供体和受体之间的距离；R0为Förster半径，即当能量转移的效率为50%时，能量供体和受体之间的距离，对于特定的体系R0可视为恒定的值；为供体和受体偶极矩的相对空间取向因子；n为溶剂的折射指数；为无受体存在的情况下，能量供体的荧光量子产率；为能量供受体对的光谱重叠积分。

在实验过程中，通常情况下通过测量能量受体存在和不存在时，所得到的供体的荧光强度或荧光寿命来计算E：

　　 （1-3）

式中，、分别为受体存在和不存在时，供体的荧光强度；相应地，、分别为受体存在和不存在时，供体的荧光寿命。

利用Förster半径R0和实验所测得的能量转移效率E就可以计算出供体与受体之间的距离r，从而可以获得关于分子结构方面的信息：

　　 （1-4）

能量转移效率E的大小受很多因素的影响，其中最主要的影响因素有如下几个方面：①光谱重叠积分（），即能量供体的发射光谱必须与受体的吸收光谱有明显的重叠。②FRET能量供受体对之间的距离（r），能量供体和受体之间的距离必须在1～10nm的范围内。FRET能量转移效率与r的六次方成反比，因此r的微小改变可以显著地影响能量转移的荧光信号。③供体和受体偶极矩的相对空间取向因子（），能量供受体在发生偶极-偶极相互作用时，必须具有良好的相互取向，它是由供体荧光团的发射偶极矩、能量受体的吸收偶极矩及二者之间的角度决定的。能量供体的偶极矩与受体分子的偶极矩平行时，供受体之间的能量转移效率高于二者相互垂直时。供受体偶极矩FRET效率将高于它们彼此垂直的情况。值的大小取决于供受体偶极矩平行的程度，当二者相互垂直时，值最小，为0；当二者相互平行时，值最大，为4。通常将假定为2/3，这是自由旋转的供受体在所有可能角度上积分的平均值。