2.4　结果与讨论

2.4.1　油田采出油水样的理化分析

油藏平均温度为73℃，深度为1801.3～1960m。水样为无色透明液体，根据原子吸收光谱分析其化学组成为Na⁺7615mg/L，Ca²⁺369mg/L，Mg²⁺ 107mg/L，Cl^- 12787mg/L，N 104mg/L，总P小于0.04mg/L，总Fe小于0.1mg/L，重金属 Mn 0.023mg/L，Si 5.47mg/L，其他重金属未检出（小于0.01mg/L），油样含胶质沥青24.8%，含蜡24.5%，50℃下黏度为110mPa·s，凝固点为42.4℃。

2.4.2　水样中细菌总DNA的提取

将从水样中提取的总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，如图2-1所示，提取前经液氮研磨法破碎细胞，最终得到的DNA浓度为21.5μg/mL（泳道1）；不经液氮研磨直接用酶法和化学法相结合的方法进行提取，得到的DNA浓度为30.6μg/mL（泳道2）。从水样中离心得到的微生物细胞数量较少，液氮研磨法是一种较为激烈的破壁方式，在操作时由于液氮飞溅势必会造成样品的损失，而且不同的裂解方法对于细菌裂解的百分比是不一样的，因此两种方法提取的总DNA存在差异。从图2-1中还可以看出所有DNA分子量均集中在23.1kb以上，证明经以上方法破壁后提取的基因组较完整。

2.4.3　DGGE分离16S rDNA V3、V8、V9区片断PCR产物

将用酶法和化学法相结合的方法提取的DNA，用16S rDNA高可变区V3、V8和V9的不同的引物P1、P2和P3进行PCR，采用40%～60%的变性剂浓度梯度进行DGGE分离，结果如图2-2所示，P1、P2和P3三对引物分离的条带分别为7条、8条和12条，根据DGGE的原理，每一个条带可能代表1种微生物，因此利用P3引物扩增16S rDNA V9区片断用DGGE分离可得到较多的条带，从而获得更多的微生物多样性信息。

2.4.4　DGGE分离不同方法提取的水样DNA的16S rDNA V9区片断PCR产物

图2-1所示2种不同的提取方法造成DNA产量的差异，但是从提取的DNA条带表明已获得较为完整的水样中微生物的总DNA，进行16S rDNA V9区 PCR-DGGE分析，结果如图2-3所示，第1泳道是直接利用酶法和化学法结合的方法提取DNA的PCR-DGGE图谱，第2泳道是经液氮处理后提取DNA的PCR-DGGE图谱，两者带型即所表现的细菌丰富度和优势菌基本一致，由于第2泳道样品在提取时采用的破壁方法较为剧烈，对某些微生物基因组的提取起到了一定的作用，使得一些条带比较亮，但是由于在操作时细胞的损失，致使所得到的条带不如第一泳道样品多。因此选用第一种方法提取的DNA进行后续实验。

2.4.5　DGGE条带比对和测序结果分析

将图2-3中第1泳道的样品分离的12个条带进行切胶回收，PCR扩增后再进行一轮DGGE，如该条带还能跑到原位置，则证明切下的条带不是杂合带或单链DNA干扰。将正确的条带进行测序，测序结果通过GenBank数据库比对（表2-2）。分析的12条DGGE条带序列中，有5条序列与GenBank数据库中未培养的微生物相似；另外，有5条序列属于变形菌，2条序列属于芽孢杆菌，其中，序列e、j与Pseudomonas属的菌株（Pseudomonas sp. EGU448和Pseudomonas andersonii）相似性都大于99%，可初步判断这2条序列所代表的微生物属于Pseudomonas属；序列h、g分别与菌株Bacillus licheniformis和Geobacillus sp. LB-1的序列相似性均高于99%，因此分别属于Bacillus属和Geobacillus属，序列i与Burkholderia sp. N1US7同源性最高，属于Burkholderia属；序列a和k与已知可培养的Iodide-oxidizing bacterium和Gamma proteobacterium相似性分别为98%和99%，都属于变形菌。

将所得序列采用软件Clustal X和Mega 3.1构建系统发育进化树（图2-4），结果发现这12个条带分别属于四大类群，与α，β，γ-变形菌（Proteobacterias）和芽孢杆菌（Bacilli）的亲缘关系较近。其中序列a、c、f、k、l与数据库中未培养微生物和已鉴定的微生物相似性相同或比较接近，因此可确定这些序列对应的微生物在属水平上的发育地位，但是序列b与数据库中未培养微生物的相似性为99%，而与已鉴定的同源性最高的微生物Methylococcus capsulatus相似性仅有94%，序列d仅与数据库中未培养菌的相似性较高，没有同源性很高的已鉴定微生物，说明这2个序列代表的微生物比较新，可能会是新的微生物物种，因此仅能确定其所属纲的发育地位。

按照各条带所代表的微生物所在属水平上的发育地位，可对油藏中微生物的功能进行初步分析，结果发现其中条带c、e、f、j代表的Pseudomonas属、条带h代表的Bacillus属、条带g代表Geobacillus属，条带i代表的Burkholderia属中有大量的烃降解微生物被报道过；条带a代表的玫瑰杆菌属（Roseobacter），被发现在海洋中参与硫的循环，条带l代表Petrobacter属是2004年从油藏中分离到的能够还原硝酸盐的新属；k代表的Rheinheimera属也是重要的极端环境微生物。

2.4.6　高温解烃菌的分离鉴定及降解特性

DGGE序列分析表明，油藏中存在有Pseudomonas、Bacillus、Geobacillus和Burkholderia等烃降解微生物菌属。Pseudomonas和Burkholderia属中多数是中温解烃菌，而Bacillus和Geobacillus两个属中有大量能够在高温条件下利用烃的微生物，如已报道的Geobacillus stearothermophilus能够利用C₁₅～C₁₇的烷烃，Bacillus thermoleovorans能够降解C₂₃，Geobacillus jurassicus能降解C₁₆。可见，有些解烃菌可利用烃的范围很窄，根据这个信息，在无机盐培养基或油藏地层水中分别加入单烷烃（C₁₃～C₂₅）作为碳源，适当添加氮源、磷源和生长因子，在不同的生长温度下（55～70℃），得到菌株DM-1、DM-2和DM-3。

采用传统富集培养法从水样中分离到两株高温菌DM-4和DM-5，直接培养法分离到高温菌DM-6和DM-7。

经传统富集培养、直接培养和DGGE指导培养分离到7株高温菌（DM-1～DM-7），经形态观察和初步生理生化实验鉴定，其中DM-3、DM-4和DM-7为同一株菌。最后得到的5株菌分别对应DGGE图谱中的条带h、g、l、f和k。降解实验表明其中有3株菌可在55℃以上兼性厌氧条件下乳化液蜡并降解原油，其中DM-2对原油的降解率可达70.01%，对原油降黏率为54.55%，降凝效果显著（表2-3）。

经16S rDNA序列分析鉴定，菌株DM-1、DM-2和DM-3分别属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、地芽孢杆菌属（Geobacillus sp.）和油杆菌属（Petrobacter sp.），在GenBank中登记的序列号分别为DQ539620、DQ309593和DQ539621，序列比对表明同源性最近的种分别是Bacillus licheniformis （AY052767，同源性100%）、Geobacillus stearothermophilus（AY608931，同源性98.97%）和Petrobacter succinimandens（AY219713，同源性98.56%）。这三株菌在进化地位上与DGGE序列中的h、g和l相对应，扩增这3株菌的16S rDNA V9区片段，与水样同时进行DGGE分离，发现这3株菌确实在水样中存在（图2-5）。如果降低筛选温度可能会得到更多的解烃菌，这需要进一步的实验探索。下一步的工作将围绕这些内源微生物在模拟油藏环境下的存在方式、协同作用，及其对提高石油采收率的贡献。