第二节 临床应用对NGS检测的要求

1．选择目标基因的一般原则

肿瘤靶向治疗是指设计靶向药物使其作用于肿瘤细胞相应的靶点，如与信号通路有关的受体、激酶等蛋白，从而特异性地杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长。所以首先要找到靶点，这是进行精准靶向治疗的关键，也是要通过NGS等检测方法来实现的。

该选择哪些基因进行NGS检测呢？对于肺癌领域的基因检测，每年NCCN等权威机构都会提出新的建议，这些都是重要的指导标准。基因大致可分为以下4种情况：① 与治疗药物靶点诊断相关的基因；② 国内外诊疗指南（如NCCN）提到的基因，包括一些Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中标靶的基因；③ 临床意义不太明确，但是有权威文献报道的基因；④ 临床意义完全不明确的基因。一般认为，前两种证据确切，更具临床意义，应该作为目前主要的检测目标。

2．临床实验室自建项目（laboratory developed tests, LDTs）的关键问题

我国临床实验室以往大多使用国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration, CFDA）批准的试剂，很少使用LDTs。很多实验室对LDTs的概念比较模糊，通常认为只有实验室自己建立的检测方法才属于LDTs。目前，我国肿瘤NGS检测的LDTs有两种情况：① 实验室购买试剂原材料，如引物、探针、扩增缓冲液、酶等，进行片段化、文库建立、测序并建立生物信息学分析系统；② 采用未经CFDA批准的商品试剂盒。

1）LDTs的建立

目前，国内使用的NGS仪器主要为Illumina Hiseq和Thermo Fisher Ion PGM为代表的测序仪，使用的基因富集方法有杂交捕获和多重PCR。几乎所有实验室采用的都是多基因检测，很少应用全外显子组测序或全基因组测序。多基因检测分为两种类型。一种是肿瘤特异性的多基因检测，如非小细胞肺癌、黑色素瘤和遗传性乳腺癌等的检测。这种检测结果较容易解读，但是检测流程相对复杂，需要根据不同的肿瘤对样本进行分类，并使用不同的试剂进行检测。另一种是临床实验室提供一组完整的多基因检测项目，但不按照肿瘤进行区分，所有患者接受的都是相同的一组基因检测。这种检测方式流程简单，只用一种检测试剂，在建立LDTs和进行性能评价时只需针对这一种检测试剂即可。无论使用商品化的试剂盒，还是实验室完全自配的试剂，都属于LDTs范畴[12]。

现在临床送检的组织样本一般是福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed and Paraffin-embedded, FFPE）的肿瘤组织。由于FFPE样本在处理过程中存在脱氨基和氧化损伤等物理化学改变，加上传统的多重PCR设计和生物信息分析过程存在一定限制，导致很多测序数据都存在错误，所以目前临床上对突变检测下限一般设定为5%[13]。在2017年发表的一篇关于颈环抑制介导的扩增技术文章中，经过特殊设计的PCR引物，可以使检测灵敏度达到2%，并且还通过了微滴式数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）的验证，能保证测序的均一性和正确性。同时该技术可以尽量减少组织异质性和损伤造成的假阴性、假阳性结果，而且操作非常简便，测序费用低，当日就可以拿到检测报告，具有非常好的临床应用价值[14]。

LDTs要求检测中使用的试剂以及标准操作程序不能随意更改。NGS检测过程中的核酸提取、片段化、文库制备、标签化、混合样品、上机测序、生物信息学分析和结果报告等均需详细说明。NGS必须有统一的测序质量标准，确保所有参数均在同一标准下进行设定。重要的质量参数还包括最低测序深度、平均测序深度、测序均一性、符合质量值要求的碱基百分比、比对到靶向区域的读长比例等。

2）LDTs的性能评价

LDTs并不需要对所有基因的突变位点进行检测，只需检测有明确意义且能指导治疗或者筛查的突变即可。

在LDTs的结果报告方面，需清晰地说明所有阳性结果，并使用人类基因组变异学会（human genome variation society, HGVS）的标准格式来报告基因突变，这点也是目前我们从多数文章中所看到的共识。总的来说，在肿瘤靶向治疗相关基因突变的NGS检测中，结果可分为4个部分进行解释：① 治疗药物靶点诊断相关的基因突变。解释时需注明证据来源，明确可用的靶向药物及其临床意义。② 国内外专业机构诊疗指南提到的基因，包括一些Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中标靶的基因突变。解释时需注明文献来源，注明可用的靶向药物及其临床意义、临床试验的阶段、开展的组织机构等。③ 临床意义不太明确，但是已有权威文献报道的基因突变。解释时须注明文献来源，说明其相关药物及临床意义，并注明仅供研究使用。④ 临床意义完全不明确的突变。实验室需明确指出目前尚不清楚该突变及临床意义，报告结果仅供研究使用。如果体细胞变异和种系变异同时存在，应分别进行报告和解释，需注明检测范围、检测下限，并对检测的局限性、突变漏检以及对结果产生影响的可能性因素进行说明。

检测结果的解读非常复杂。国外有的临床实验室在一些数据库（如ClinVar数据库等）的基础上，将生物信息学分析的部分添加了临床意义的解读，而且定期对软件进行更新，这可能有助于人们将结果解读进行规范化。不过，目前国内多数临床实验室的生物信息学分析都不包含这一部分，所以当出现临床意义不明确的检测结果时，还需要面临如何与临床医师沟通的问题[14]。

由于检测批次、实验操作人员、分析过程等都可能存在差异，所以LDTs对于每一批数据，都要进行严格的质量控制，这点和传统检测要求是一样的。国家和地方卫生主管部门近两年来加强了对LDTs的质量控制和指导，也公布了第二批室间质量评价结果。从2018年1月份最新公布的结果来看，虽然满分企业比第一批有所提高，但整体还需要大幅改进。NGS测序市场快速成长的同时也伴随产生众多问题，只有不断完善和加强质量管理，提高检测结果的准确性，才能更好地服务于广大患者。

随着越来越多的靶向治疗药物获得批准或进入临床研究，NGS在肿瘤多基因检测上有广阔的应用前景，并逐步从组织样本检测进入到循环肿瘤DNA的“液体活检”时代。选择合适的靶基因，制订严格的LDTs建立、配制、检测等相关标准操作程序，并充分进行应用前的性能评估，加上检测中的来料质量控制和室间质量评价，最后严谨、客观、准确地进行结果解读，才能充分体现NGS在肿瘤基因突变检测中的临床价值。