实验五 蛋白质的呈色反应

蛋白质的呈色反应是由于蛋白质中某些氨基酸特殊基团与一定的化学试剂作用而呈现的各种颜色反应。蛋白质的呈色反应可作为检查蛋白质是否存在的参考。另外，不同的蛋白质中，氨基酸的种类及含量各不相同，而在某些蛋白质内还可能缺乏呈某种颜色反应的氨基酸。因此，不但不同蛋白质呈色反应的强度各不相同，而且某些呈色反应在某种蛋白质可能不存在。本实验介绍三种呈色反应，用以比较和鉴别不同的蛋白质。

（一）双缩脲反应

【原理】

在浓碱液中，双缩脲能与硫酸铜结合生成紫色或紫红色的复合化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。

凡含有两个肽键（-CO-NH-）以上的化合物都有双缩脲反应，故一切蛋白质及二肽以上的物质都有此反应。但除肽键外，有些基团如-CSNH-、=C（NH2）NH-和-CH2NH-等亦有双缩脲反应。因此，一切蛋白质或多肽都有双缩脲反应，但有双缩尿反应的不一定都是蛋白质或多肽。

【操作】

（1）取小试管1支，加1∶10鸡蛋白溶液2滴、10%NaOH溶液5滴及1%硫酸铜溶液1滴，混匀后，呈紫红色的双缩脲反应。

（2）另取小试管1支，加小匙尿素，小火加热至熔，试嗅其气味。继续加热使之凝固，这固体是什么？加水15滴使溶，然后加10%NaOH 5滴，1%硫酸铜1滴，可见什么现象？

【试剂】

（1）1∶10鸡蛋白溶液。

（2）10%NaOH溶液。

（3）1%CuSO4溶液。

（4）尿素。

（二）茚三酮反应

【原理】

凡含有自由氨基的化合物例如蛋白质、多肽、各种氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸例外）和其他伯胺化合物（包括氨），与茚三酮共热时，能生成紫蓝色化合物。这种反应称茚三酮反应。

【操作】

（1）取小试管1支，加1∶10鸡蛋白溶液4滴，蒸馏水10滴和0.1%茚三酮乙醇液6滴，混匀，于沸水浴中加热约1分钟，待冷却后溶液即呈粉红色，以后慢慢变成紫色或蓝色。

（2）取小试管1支，加丙氨酸4滴，重复上述操作，观察结果。

【试剂】

（1）1∶10鸡蛋白溶液。

（2）0.1%茚三酮乙醇溶液。

（3）0.25%丙氨酸溶液，称取丙氨酸0.25g加水至100mL。

（三）福林-但尼士（Folin-Denis）反应

【原理】

酚类化合物能在碱性溶液中还原酚试剂（又名磷钼钨酸试剂）中的Mo6+生成蓝色的钼蓝，这种呈色反应称为福林-但尼士反映。蛋白质分子中的酪氨酸与色氨酸残基也有此反映。所以本反应可作为蛋白质定性或定量的依据。但各种蛋白质所含酪氨酸及色氨酸的量不尽相同，呈色的深度有差别。白明胶几乎不含芳香族氨基酸，因此对此反应生色很浅。利用福林-但尼士反应做蛋白质含量的比色测定应选用同来源的蛋白质作标准，否则可产生较大的误差。

【操作】

（1）取1∶10鸡蛋白溶液2滴置试管中，加饱和Na2CO3溶液3滴，蒸馏水6滴，酚试剂1滴，混匀，观察颜色变化。

（2）分别取0.25%白明胶溶液，0.25%酚溶液及0.25%酪氨酸溶液替代鸡蛋白溶液重复上述操作。

【试剂】

（1）1∶10鸡蛋白溶液。

（2）0.25%白明胶溶液。

（3）0.25%酚溶液。

（4）0.25%酪氨酸溶液，称取酪氨酸0.25g加水至100mL。

（5）饱和Na2CO3溶液。

（6）酚试剂，称取100g钨酸钠，25g钼酸钠与700mL水，50mL85%磷酸，100mL浓盐酸，在1500mL圆底烧瓶中混合，缓缓地加热回流10小时，再加150g硫酸锂，50mL水及3滴溴水。取下冷凝管，煮沸15分钟以除去过多的溴。冷却后稀释至1L，过滤。此试剂不应呈绿色，保存在棕色瓶内。使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂而后稀释约1倍，使最后浓度为1mol/L。

（四）未知物的鉴定

现有5瓶没贴标签的溶液，它们分别是：酚、双缩脲、丙氨酸、清蛋白，试设法一一鉴定之。

解释以上结果。